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3T3-L1細胞分導誘化（微生物實驗室氣溶膠污染預防與控制）
發(fā)布：admin 發(fā)布時間：2021-12-18 14:47:28 瀏覽：
研究表明已知原因的實驗室感染只占全部感染的18%，不明原因的實驗室感染卻高達82%。對不明原因的實驗室感染的研究表明，醫(yī)學實驗室的許多操作可以產生氣溶膠，由于其氣溶膠分子小，易漂浮在空氣中，大多數(shù)可能是病原微生物形成的感染性氣溶膠在空氣擴散而污染實驗室的空氣，當工作人員吸入了污染的空氣，便可以引起實驗室相關感染。在病原微生物實驗室中，產生的微生物氣溶膠可分為兩大類：一類是飛沫核氣溶膠，另一類是粉塵氣溶膠。
這兩類微生物氣溶膠對實驗室工作人員都具有嚴重的危害性，其程度取決于微生物本身的毒力、氣溶膠的濃度、氣溶膠粒子大小以及當時實驗室內的微小氣候條件。一般來說，微生物氣溶膠顆粒越多，粒徑越小，實驗室的環(huán)境越適合微生物生存，引起實驗室感染的可能性就越大。
在離心、燒接種環(huán)、劇烈震蕩或混勻時極易形成帶菌的氣溶膠。因此樣本的離心工作必須在開放實驗室內進行，真空采血管須在生物安全柜中打開或在離心機中靜置30min后才能打開。細菌室酒精燈火焰上應套一個長管，使酒精燈火焰上方有充足的無菌空間，最好使用焚燒燈。
任何有可能產生細顆粒氣溶膠的操作步驟(如標本編號、血清分離、細菌接種等)標本處理原則上在有合格證的生物安全柜內進行。對于暫無生物安全柜的實驗室，可在超凈臺內處理標本，但切不可開啟排風裝置，以減少病毒在空氣中彌散。處理標本使用專用離心機，離心時應使用密閉的離心機轉頭或密閉樣品杯。理想情況下，應在生物安全柜內取出離心機轉頭或樣品杯。離心機使用完畢，立即用含有效氯1500mg/L消毒液進行表面消毒。因此做好醫(yī)學實驗微生物氣溶膠的凈化工作，有助于降低院內感染的發(fā)生，保護在場所工作的人員的安全。
一、微生物氣溶膠的定義
是指液體或固體微粒均勻地分散在氣體中形成的相對穩(wěn)定的懸浮體系。
微生物氣溶膠是一群形體微小，構造簡單的單細胞或接近單細胞的生物懸浮于空氣中所成的膠體體系。粒子大小在0.01～100μμm，一般為0.1～30μm。
二、微生物氣溶膠的特點
1、生物氣溶膠無色無味、無孔不入，不易發(fā)現(xiàn)，實驗人員在自然呼吸中不知不覺吸入而造成感染。若治療控制不及時會造成嚴重后果。
2、與其自然感染的疾病相比，有些微生物氣溶膠感染的癥狀不典型，病程復雜，難以及時診治，影響預后。
3、有些氣溶膠感染只有呼吸道粘膜免疫才有預防作用，非呼吸道免疫途徑預防作用效果欠佳?，F(xiàn)有常規(guī)疫苗的預防效果不理想，如肺炭疽。
4、呼吸道傳播的傳染病的微生物特別是高致病性病毒常常發(fā)生變異，尤其是其抗原性、致病性都可能發(fā)生改變，在空氣中存活力增強。
5、氣溶膠傳播容易發(fā)生病原體在人與人、人與動物、動物與動物之間的傳播。
6、可以遠距離或較遠距離傳播，這是其與其他傳播途徑的顯著區(qū)別，也是氣溶膠傳播難以預防的另一重要原因。
醫(yī)學實驗室氣溶膠污染凈化的國家標準要求：
(1) 低溫高速離心機或其他可能產生氣溶膠的設備應置于負壓罩或其他排風裝置(通風櫥、排氣罩等)之中，應將其可能產生的氣溶膠經高效過濾后排出。
(2) 污染區(qū)內應設置不排蒸汽的高壓蒸汽滅菌器或其他消毒裝置。
安全防護防止氣溶膠的擴散與吸入
防止氣溶膠的擴散
無論是哪一種微生物實驗室，只要操作感染性物質，氣溶膠的產生是不可避免的。因此，除了控制空氣傳播感染的第一環(huán)節(jié)，還要防止氣溶膠擴散，這是控制空氣傳播感染的第二環(huán)節(jié)。在實驗室中，有多種措施可以有效防止氣溶膠的擴散，例如“圍場操作”、“屏障隔開”、“有效攔截”、“定向氣流”、“空氣消毒”等，這些防護措施的綜合利用可以獲得良好的效果。
1、圍場操作：圍場操作是把感染性物質局限在一個盡可能小的空間(例如生物安全柜)內進行操作，使之不與人體直接接觸，并與開放之空氣隔離，避免人的暴露。實驗室也是圍場，是第二道防線，可起到“雙重保護”作用。圍場大小要適宜，以達到既保證安全又經濟合理的目的。目前，進行圍場操作的設施設備往往組合應用了機械、氣幕、負壓等多種防護原理。
2、屏障隔離：氣溶膠一旦產生并突破圍場，要靠各種屏障防止其擴散，因此也可以視為第二層圍場。例如，生物安全實驗室圍護結構及其緩沖室或通道，能防止氣溶膠進一步擴散，保護環(huán)境和公眾健康。按國家標準《實驗室生物安全通用要求》的要求，進出核心實驗室的緩沖間是必需的設置。這是因為：
(1) 避免污染擴散，盡可能把污染限制在最小的范圍內;
(2) 一旦室內出現(xiàn)正壓，工作人員可在緩沖室內換氣、凈化空氣、安全撤離;
(3) 退出實驗室時可在其內換鞋、脫去外層衣服和手套、必要的消毒，避免內層衣服污染或污染其他房間。
3、定向氣流：對生物安全三級以上實驗室的要求是保持定向氣流。其要求包括：
(1) 實驗室周圍的空氣應向實驗室內流動?以杜絕污染空氣向外擴散的可能，保證不危及公眾;
(2) 在實驗室內部，清潔區(qū)的空氣應向操作區(qū)流動，保證沒有逆流，以減少工作人員暴露的機會;
(3) 輕污染區(qū)的空氣應向污染嚴重的區(qū)域流動。
以BSL-3實驗室為例，原則上半污染區(qū)與外界氣壓相比應為一20Pa，核心實驗室氣壓與半污染區(qū)相比也應為一20Pa，感染動物房和解剖室的氣壓應低于普通BSL-3實驗室核心區(qū)。
4、有效消毒滅菌：實驗室生物安全的各個環(huán)節(jié)都少不了消毒技術的應用，實驗室的消毒主要包括空氣、表面、儀器、廢物、廢水等的消毒滅菌。在應用中應注意根據(jù)生物因子的特性和消毒對象進行有針對性的選擇。并應注意環(huán)境條件對消毒效果的影響。凡此種種，都應在操作規(guī)程中有詳細規(guī)定。
5、有效攔截：是指生物安全實驗室內的空氣在排人大氣之前，必須通過高效粒子空氣(HEPA)過濾器過濾，將其中感染性顆粒阻攔在濾材上。這種方法簡單、有效、經濟實用。HEPA濾器的濾材是多層、網格交錯排列的，因此其攔截感染性氣溶膠顆粒的原理在于：
(1) 過篩：直徑小于濾材網眼的顆?？赡芡ㄟ^，大于的被攔截;
(2) 沉降：對于直徑0.3/zm以上的氣溶膠粒子作用較強。氣溶膠粒子直徑雖然小于網眼，由于粒子的重力和熱沉降或靜電沉降作用也可能被阻攔在濾材上;
(3) 慣性撞擊：氣溶膠粒子直徑雖然小于網眼，由于粒子的慣性撞擊作用也可能阻攔在濾材上;
(4) 粒子擴散：對于直徑小于o.1Um的氣溶膠粒子作用較強，氣溶膠粒子雖然小于網眼，由于粒子的擴散作用也可能被阻攔在濾材上。
依照上述原理，最不容易濾除的粒子是0.1～0.3um的粒子。
防止氣溶膠的吸入
盡管采取了上述防止氣溶膠擴散的種種措施，但由于氣溶膠具有很強的擴散能力，還是不可避免地污染實驗室的空氣。所以，實驗室工作人員仍然需要進行個人防護，以防止氣溶膠吸人。
氣溶膠的傳染
今后在室內生物氣溶膠重點應放在應用基礎上，主要有：
1、室內生物氣溶膠的來源和危害性;
2、室內生物氣溶膠污染與疾病的關系;
3、影響室內生物氣溶膠的環(huán)境因素;
4、室內微生物環(huán)境下生物氣溶膠的有益應用;
5、控制室內生物氣溶膠的技術;
6、研究生物氣溶膠檢測儀和大流量空氣微生物采樣器;
7、規(guī)范室內生物氣溶膠研究方法和程序
通過以上7個方面的研究，可以從根本上預防和控制室內生物污染，改善空氣質量，包括工作環(huán)境的空氣質量的居住環(huán)境的空氣質量，從而達到預防疾病的目的。
首先細胞數(shù)一定要夠，接觸抑制后，加誘導液，誘導液一(IBMX是SIGMA的，濃度我用0.5m mol/l,配的時候用DMSO濃縮1000倍，DEX用的是Solarbio分裝的100MG的也用DMSO溶，Ins用的人用胰島素)，最主要的是要細胞代數(shù)20代以內，換誘導液2時不用1ML的移液槍加用200ul的慢慢加.
讓細胞長滿以后，接觸抑制2天(是細胞退出生長周期)，加入含有IBMX(一般使用濃度0.5mmol/L)，DEX(地塞米松，一般使用濃度是 1umol/L)和insulin(胰島素，一般使用濃度1-10ug/ml)的培基2天，再換成只含胰島素的培基2天，然后每兩天換液(普通培基)。這 是分化的步驟，但是最關鍵的是細胞的傳代次數(shù)，細胞傳代次數(shù)較多，分化率很低。一般說不能超過20代，最好在10代以內。誘導分化中，細胞的傳代數(shù)和狀態(tài)是最重要的。
誘導劑的配制
IBMX(異丁基-甲基-黃嘌呤): 分子量：222.2(Sigma:I5879)-20度保存
用二甲基亞砜DMSO配制111.1mg/ml(0.5mol/L)儲存液
終濃度為0.5mmol/L,即每100ml培養(yǎng)液加100ul儲存液。
DEX： 分子量：392.5(Sigma:D4902)-20度保存
用無水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)儲存液
終濃度為1umol/L,即每100ml培養(yǎng)液加40ul儲存液?？捎?年。
Insulin：分子量：6000 ,4度保存
原液為諾和靈R：400IU/10ml
終濃度為10ug/ml,即每100ml培養(yǎng)液加600ul原液。4度保存
3T3-L1前脂肪細胞株的誘導分化
將3T3-L1前脂肪細胞接種于培養(yǎng)板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5%CO2培養(yǎng);
待細胞長滿至80-90%，融合2天(融合的意思是指讓細胞接觸抑制，就是長滿后換液讓其再長兩天)后，加含終濃度為0.5mmol/L IBMX(儲存液濃度0.5mmol/L)、終濃度為1umol/L(儲存液濃度為1mg/ml(2.5mmol/L))DEX和終濃度為10ug/ml的胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)48h;(誘導劑臨用時再加到培液中混勻)
48h后換含終濃度為10ug/ml的胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液再培養(yǎng)48h，48h后再換10%小牛血清高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，2天后換培養(yǎng)液一次，誘導分化8～12天3T3-L1細胞90%多呈成熟脂肪細胞表型，可用于實驗。
誘導操作注意事項：
1、 一共需誘導3次，每次誘導的時間點最好固定，保證誘導劑作用夠48h，若時間沖突誘導的時間只可延長，不可短于48h。
2、 誘導操作需注意：以6孔板為例，每孔3ml培液，一個6孔板需18ml培液，則第一次誘導時誘導劑的劑量分別是：IBMX18ul(儲存液)，DEX7.2ul儲存液，胰島素108ul(儲存液)。第一遍誘導時用200ul的移液槍先每孔加200ul配制好的誘導液，沿孔壁邊緣來回橫著劃慢慢注下培液，動作一定要慢，不然細胞會飄起來，俗稱卷邊。每孔加5遍200ul培液，合計1ml，第二、三遍則每孔1000ul加培液，方法同上，操作要慢、輕。
3、 第2次誘導時，誘導劑的配制為：18ml培液，加胰島素108ul(儲存液)，混勻，操作步驟同前。第一次和第二次誘導很重要，動作一定要慢。第3次誘導誘導僅需換10%高糖DMEM培液，但操作步驟同前，一般結果好的話第三次誘導之前細胞內可見少量小脂滴，培液變黃，因為細胞里有脂滴了所以培液看起來就黃了。
4、 第三次誘導以后，可見細胞內脂滴變大，但此時仍有細胞內的脂滴剛誘導出來，需要兩天后再次換液，此時換液則可每次1ml的培液換，一般換液2天后幾乎所有細胞內均可見脂滴，且脂滴較大，可用于加藥處理。
細胞是否誘導成功細胞代數(shù)很重要，代數(shù)越靠后，細胞狀態(tài)越不好，越容易卷邊。
3T3-L1細胞的誘導分化，在前兩天的融合期的時候，確定你用的是DMEM高糖+小牛血清，在細胞高度融合以后才能開始進行第一階段的誘導(MDI誘 導，DMEM高糖+胎牛血清)，第一階段后，細胞中可以觀察到細胞已經開始變圓，第二階段的誘導(insulin誘導，DMEM高糖+胎牛血清)，細胞中 就可以觀察到脂肪滴，進入第三個階段的誘導的時候，脂肪滴的聚集更加明顯。誘導劑如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX是在一定濃度的KOH溶解的，insulin是在一定濃度的HCL中溶解的，誘導分化的程度也和細胞有關，同為3T3-L1細胞，但是每種細胞的分化能力有很大的差異，在沒有進入分化誘導的時候，一定不能用胎牛血清來養(yǎng)細胞，在分化期有少量的細胞出現(xiàn)死亡是正常的1兩天進行一次換液，因此一定要小心被污染!
因為3T3-L1加入誘導劑以后，收縮得很厲害，比較脆弱，很容易就飄起來。所以加誘導劑的時候，手法要特別輕，最好用槍頭加，不要用移液管，因為移液管家的時候很難控制流速，力度大。用槍頭加誘導劑的時候，一定要貼壁加，讓液體慢慢留下，這樣對細胞的沖擊小。我正在做誘導分化，感覺細胞飄起來一小部分的話，還是能用，沒有什么大的影響，如果范圍比較大的話最好重新誘導。你的誘導劑的濃度與一般人用的濃度不太一樣。IBMX大家一般都是用 0.5mmol/L，胰島素一般都是1-10ug/ml，dex有用0.25，1，10umol/L的。
一定要在細胞狀態(tài)好的情況下誘導分化，3T3-L1長得非?？?，如果長滿以后不換液，會有大批細胞死亡，判斷細胞好壞的標準是cell confluent 后，培養(yǎng)基中很少有漂浮的死亡細胞。所以誘導前傳代的細胞在接種時數(shù)量不要太大，最好在10*4數(shù)量級，這樣讓細胞長3天后鋪滿，再換液，再讓細胞長 2-3天，這時的細胞會退出生長周期，進入growth arrest狀態(tài)。2，IBMX的溶解方法有多種，不同文獻有不同方法，DMSO，乙醇，濃鹽酸，KOH溶液都可，針對你所說的出現(xiàn)結晶問題建議你用1M KOH試試，即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH，3，胰島素濃度大一點只會促進分化，不會有抑制作用，因為Preadiopocyte細胞膜上胰島素受體很少，所以需加超過生理濃度的insulin，以其激活細胞膜上的IGF1受體，通過IGF1通路來誘導分化。
