全國服務(wù)熱線15920332561
全國咨詢熱線15920332561
細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序（THP-1 細(xì)胞培養(yǎng)）
發(fā)布：admin 發(fā)布時間：2021-12-18 14:43:45 瀏覽：
THP-1是人外周血的單核細(xì)胞系，最初來源于急性單核細(xì)胞性白血病患者。屬于懸浮細(xì)胞，適合用于轉(zhuǎn)染或感染實(shí)驗(yàn)。其表面抗原HLA型為：A2，A9，B5，DRw1，DRw2。
工具/原料
· 培養(yǎng)基：RPMI-1640 (Invitrogen #11875-093)
· 胎牛血清：Fetal Bovine Serum (FBS, GIBCO #10099-141)
· 二甲亞砜：DMSO (SIGMA D2650)
· 雙抗P/S (Penicillin/Streptomycin)(GIBCO #15140-122)
方法/步驟
細(xì)胞培養(yǎng)：THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS+1%P/S的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2。可以每隔3-4天加一些新鮮的培養(yǎng)基，或直接傳代。
細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約8x10^5cells/ml左右時，即可進(jìn)行傳代。由于是懸浮細(xì)胞，可直接將細(xì)胞吸出，離心之后傳代。傳代最少濃度不應(yīng)少于1x10^5 cells/ml。
細(xì)胞凍存：取差不多1x10^7個細(xì)胞，用1ml含有10%DMSO的FBS重懸，轉(zhuǎn)入凍存管，于-80℃冰箱過夜。第二天移入液氮中長期保存。
注意事項(xiàng)
· 細(xì)胞養(yǎng)不好，可能的原因有，THP-1細(xì)胞特別依賴細(xì)胞濃度，ATCC上10 5到106每ML，是一個很高的密度，細(xì)胞少了就不太容易養(yǎng)好。
· 細(xì)胞株的來源很重要，如直接來源于ATCC(American Type Culture Collection 美國模式菌種保藏中心)生命力要強(qiáng)于國內(nèi)細(xì)胞庫的。
· 注意細(xì)胞的密度一定要高，介于5×105—— 106/ML之間，增值的快。細(xì)胞數(shù)量太少，不適合THP-1生長，一般狀態(tài)不好的THP-1在培養(yǎng)了3天后數(shù)量仍然不多，繼續(xù)培養(yǎng)一天或者兩天，培養(yǎng)基 嚴(yán)重泛黃，細(xì)胞數(shù)會增加。這一點(diǎn)不同于同是單核細(xì)胞系的U937細(xì)胞。
· THP-1細(xì)胞適合在細(xì)胞Ph環(huán)境偏酸性環(huán)境生長，對培養(yǎng)基變化非常敏感，所以 盡量使用相同Ph的1640。
· 傳代后切忌常移出培養(yǎng)箱觀察，否則會影響細(xì)胞生長，狀態(tài)變差，一般首先表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)顆粒變多。一般THP-1 生長相當(dāng)快，對于狀態(tài)已經(jīng)不好的情況，建議傳代后3～4天再觀察，一般4天時間培養(yǎng)基已明顯泛黃，細(xì)胞數(shù)量巨增;1)THP-1細(xì)胞喜歡酸性條件，你不要老是換培養(yǎng)基。越酸的條件，細(xì)胞密度越大，細(xì)胞就長得越好;2)不要頻繁換液，一般2-3次換液離心一次(只是補(bǔ)充培養(yǎng)基)3) 使用1640(ATCC推薦)，注意加碳酸氫鈉2.5g就可以了，寧酸勿堿; 4)注意凍存的時候密度大些，推薦用血清凍存。
· 復(fù)蘇比較慢，建議開始用小瓶，不要用一次性的。
1.目的：
為了保證培養(yǎng)細(xì)胞的正常生長，實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員必須明確并正確執(zhí)行細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作步驟，特制訂實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)操作流程。
2.適用范圍：
適用于來我院細(xì)胞室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)工作的人員。
3.操作規(guī)程：
3.1 培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶的配制
3.1.1 1000ml培養(yǎng)液的配制
1、準(zhǔn)備用品：培養(yǎng)粉、1000ml燒杯、玻棒、量筒、電子分析天平、PH儀、2～3天內(nèi)的新鮮三蒸水(或新鮮反滲水)、NaHCO3粉、1000ml無菌玻璃瓶(100ml×10個玻璃瓶)、青霉素、鏈霉素、2～3個過濾器、注射器。紫外線照臺30min。
2、將培養(yǎng)粉用900ml新鮮三蒸水(或新鮮反滲水)溶解，并沖洗袋內(nèi)殘留粉末。
3、充分?jǐn)嚢?，按說明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等)，再充分?jǐn)嚢?。無需加谷氨酰胺，因該培養(yǎng)基里已含有。
4、用1M(1mol/L)HCl 調(diào)PH至7.0左右(細(xì)胞適宜在PH7.2～7.4生長，配制好后PH值會升高0.2～0.3，故配時調(diào)PH至7.0左右)。
5、用新鮮三蒸水(或新鮮反滲水)定容到1000ml。
6、配青霉素 80萬/瓶 + 4ml 蒸餾水 溶解
配鏈霉素100萬/瓶 + 4ml 蒸餾水 溶解
取0.5ml青霉素和0.4ml鏈霉素加入到1000ml培養(yǎng)液中，使其終濃度均為100U/ml，充分?jǐn)嚢杌靹颉?/p>
7、在無菌操作臺里用0.22um的除菌濾膜過濾配制好的培養(yǎng)液，并分裝到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，蓋上橡皮塞，放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
注意：
(1)配制培養(yǎng)液及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液PH值所使用的HCl和(或)NaOH均需新鮮三蒸水(或新鮮反滲水)配制。
一般于配制當(dāng)天制備，以保證水的純度和質(zhì)量。
(2)準(zhǔn)備的100ml×10個玻璃瓶必須事先高壓滅菌!燒杯、量筒、玻棒、盛新鮮三蒸水(或新鮮反滲
水)的容器均不需高壓滅菌，干凈即可。
3.1.2 PBS(平衡鹽溶液)的配制
NaCl 8g
KCl 0.2g +新鮮三蒸水(或新鮮反滲水)至1000ml
Na2HPO4*H2O 1.56g
KH2PO4 0.2g
(1) 無需調(diào)PH值，其成分溶解后PH為7.4，不需除菌濾膜過濾除菌，放于4℃保存，用前直接高壓滅菌(高壓時，裝PBS的瓶子的瓶蓋要插針頭!)
(2) Na2HPO4*H2O 1.56g 則Na2HPO4*12 H2O需3.4888g
(3) 如欲配制500ml，以上成分減半即可
3.1.3 0.25%胰蛋白酶的配制
胰蛋白酶粉 2.5g
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉) 0.3g
NaCl 8.0g
KCl 0.4g ` +新鮮三蒸水(或新鮮反滲水)至1000ML
NaHCO3 0.5g
Glucose(葡萄糖) 1.0g
酚紅 0.06g
(1)配出來的PH值為7.6，在PH值7.6～7.8范圍內(nèi)，故不需調(diào)PH值。
(2)用0.22um的除菌濾膜過濾分裝，瓶口用薄膜封口，放-20℃保存?zhèn)溆谩?℃可連續(xù)使用1月左右。
(3)用于分裝的玻璃瓶必須事先高壓滅菌!而燒杯、量筒、玻棒、盛新鮮三蒸水(或新鮮反滲水)的容器均不需高壓滅菌，干凈即可。
(4)如欲配制500ml，以上成分減半即可
3.2 細(xì)胞復(fù)蘇
1、準(zhǔn)備：紫外線照臺30min，準(zhǔn)備好裝有高壓滅菌好的吸管、試管的飯盒、廢液缸;培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘。在操作臺上擺放好物品，左邊為飯盒、培養(yǎng)液等，中間為酒精燈、試管架等，右邊放滴管架、鑷子，右上角放廢液缸。
2、灼燒培養(yǎng)瓶口及瓶蓋，用滴管取培養(yǎng)基5ml加入試管中(一滴約為50ul)。
3、戴手套，從-196℃液氮罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴箱中快速解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。(慢凍快融)
4、用吸細(xì)胞液的滴管從凍存管中完全吸出細(xì)胞懸液，加入到已裝有培養(yǎng)基的試管中，塞子塞試管，800rpm離心2min(用培養(yǎng)基且離心的目的:去除細(xì)胞冷凍保護(hù)劑DMSO，因常溫下其對細(xì)胞毒性大)，棄上清，試管底部的白色物質(zhì)為細(xì)胞，輕彈混勻。往試管中加培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清)各80滴和20滴(使FBS濃度為20%)。用吸細(xì)胞液的滴管輕輕吹打，使細(xì)胞混勻，以免在培養(yǎng)瓶里成團(tuán)，影響細(xì)胞生長。
5、將試管中的細(xì)胞懸液用吸細(xì)胞液的滴管全部吸出，加到培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記日期、細(xì)胞名稱，再把培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱。(注意：加入到培養(yǎng)瓶后，培養(yǎng)瓶輕輕平放，用手拿培養(yǎng)瓶側(cè)壁，左右上下輕輕搖晃幾次，使細(xì)胞均勻貼壁在培養(yǎng)瓶底。)
6、收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面整潔。
注意：
(1)入細(xì)胞室前觀察CO2%壓力，5-7.5mPa左右，減壓器表壓力不低于0.1mPa!
(2)剛復(fù)蘇的細(xì)胞需要的營養(yǎng)成分更多些，讓FBS濃度達(dá)到20%。
(3)離心時間為1～2min，速度為800轉(zhuǎn)，不要離心太久，避免對細(xì)胞傷害較大。
(4)滴管使用注意事項(xiàng)：
a.吸細(xì)胞液專用一個滴管，各株細(xì)胞的滴管一定要嚴(yán)格分開，不能混用，防止細(xì)胞間污染。
b.培養(yǎng)基和FBS(胎牛血清)可以用一個滴管，但分開用更好!
c. FBS(胎牛血清)不能和胰酶用一根滴管,因?yàn)檠鍖σ让富钚杂幸种谱饔谩?/p>
d.胰酶和PBS(平衡鹽溶液)可以用一根滴管，不過最好分開
(5)不是所有的細(xì)胞復(fù)蘇后都能活。死亡原因：凍存時間太長(如2年以上)，技術(shù)不過關(guān)(如吹打太激烈)、細(xì)胞傳代數(shù)太多等。
(6)關(guān)于PBS(平衡鹽溶液):
a. PBS溶液配好后要高壓滅菌后才能用;PBS高壓時其瓶塞一定要插針頭。
b. PBS和培養(yǎng)基都可以沖洗培養(yǎng)瓶里細(xì)胞中的雜質(zhì)，但需用溫過的PBS沖洗細(xì)胞中的雜質(zhì)。PBS雖然沖洗雜質(zhì)效果較好，但它有使細(xì)胞易脫壁的傾向，故不可經(jīng)常沖洗細(xì)胞。
c.不溫的PBS用來做難消化細(xì)胞消化前沖洗一遍的準(zhǔn)備，使細(xì)胞加入胰酶后易消化。
d.消化后暫時不養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，可以往其中加入2～3ml PBS(防止培養(yǎng)瓶干燥)，培養(yǎng)瓶放CO2培養(yǎng)箱里短時間保存。下次用該培養(yǎng)瓶再養(yǎng)同種細(xì)胞時，把PBS吸出棄去，再用培養(yǎng)基沖洗一遍即可再用。
(7)DMSO(二甲基亞砜)在常溫下對細(xì)胞毒性較大，而在4℃時，其毒性大大減弱，故凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后應(yīng)及時洗滌冷凍保護(hù)劑DMSO(離心后棄去上清)，防止DMSO在常溫下對細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性!
3.3 細(xì)胞換液
1、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)：
a.移動細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，觀察到呈漂浮狀態(tài)的細(xì)胞為死細(xì)胞;
b.生長狀態(tài)良好的細(xì)胞：透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓不清;能看清部分細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時可以見到很多分裂期細(xì)胞。
c.生長狀態(tài)不良的細(xì)胞: 細(xì)胞折光性變?nèi)?，輪廓增?qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒樣物質(zhì)，細(xì)胞間空隙加大，細(xì)胞變得不規(guī)則，失去原有特點(diǎn)。
d.只有生長狀態(tài)良好的細(xì)胞才適合進(jìn)一步傳代和實(shí)驗(yàn)。
2、紫外線照臺30min，準(zhǔn)備好吸管、試管飯盒，溫育培養(yǎng)基，F(xiàn)BS(胎牛血清)可不溫。實(shí)驗(yàn)開始時打開照明燈和抽風(fēng)機(jī)，用75%酒精噴雙手。酒精燈點(diǎn)燃放中間。滴管放滴管架上，從左到右順序?yàn)椋何?xì)胞液的滴管、吸培養(yǎng)基的滴管、吸FBS(胎牛血清)的滴管。從水浴箱中取出培養(yǎng)基，擦干水放入操作臺的左邊。
3、從CO2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在酒精燈外焰上旋轉(zhuǎn)灼燒其瓶口、蓋子處(注意不要把膠蓋燒焦)，滴管(前端90%部位)灼燒。細(xì)胞培養(yǎng)瓶傾斜，用吸細(xì)胞液的滴管吸出舊液棄到廢液碗中，盡量吸干凈。注意：滴管的膠頭應(yīng)在瓶外壓緊再伸進(jìn)培養(yǎng)瓶內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡，且不要伸入瓶內(nèi)太多，防止造成污染;滴管尖端懸空棄液，不要觸到廢液碗(要親眼看到棄液，防止滴管尖端觸到廢液碗)!
4、用吸培養(yǎng)基的滴管吸取培養(yǎng)基90滴加入到培養(yǎng)瓶(25c㎡)中，再用吸FBS(胎牛血清)的滴管吸取FBS 10滴加入到培養(yǎng)瓶中。(使FBS濃度為10%)
5、旋緊細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋后，再旋回半圈，以利于空氣流通。平放回CO2培養(yǎng)箱中。
6、收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面整潔。
注意:
(1)在打開培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清)、培養(yǎng)瓶前后均需旋轉(zhuǎn)灼燒其瓶口和瓶蓋，嚴(yán)格注意無菌操作。滅菌飯盒只能在無菌操作臺里打開。
(2)鑷子每次使用前均需灼燒。裝FBS的瓶子瓶蓋小，用鑷子夾住蓋子灼燒后，再用其夾住瓶蓋蓋上;取其瓶蓋時也是用鑷子夾住瓶蓋取下蓋子。
(3)滴管在第一次使用前也需灼燒。注意：除吸取細(xì)胞液的滴管外，其他滴管滴加液體時都要懸空滴加。已吸過液體的滴管在再次使用前決不能再灼燒!滴管千萬不能混用!
(4)培養(yǎng)瓶口不要對著自己，不加試劑時要平放。
(5)培養(yǎng)液以沒過細(xì)胞為宜。
(6)細(xì)胞液顏色變黃，死細(xì)胞多時換液。不要求每天換液，容易增加污染機(jī)會。
3.4 細(xì)胞計數(shù)
1、原理：
(1)計算細(xì)胞數(shù)目用血球計數(shù)盤計數(shù)。
(2)血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細(xì)刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細(xì)刻16個小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×104
注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。
2、計數(shù)方法：
(1) 75%酒精棉簽清潔蓋玻片及計數(shù)板，再用干紗布或棉簽再擦一遍，放好蓋玻片。
(2) 用滴管從已經(jīng)吹打混勻的細(xì)胞懸液中取一滴滴在計數(shù)板周邊，再用加樣槍吹打混勻該滴液體，從中吸取13ul至蓋玻片邊緣(注意不要溢出，不要有氣泡)。
(3) 觀察計數(shù)：壓線的記左不記右，記上不記下;成團(tuán)的細(xì)胞只記為1個;先用低倍鏡(紅色，4×)找出大位置，再用中倍鏡(黃色，10×)進(jìn)行計數(shù)。
細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×104
(4) 計數(shù)完畢用75%酒精棉簽擦蓋玻片及計數(shù)板，再用干紗布(或干棉簽)擦一遍。
3.5 細(xì)胞傳代
1、紫外線照臺30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需物品。
2、取滅菌試管1支，配完全培養(yǎng)基(含10%FBS)3ml(培養(yǎng)基:FBS=54滴：6滴)。
3、用吸細(xì)胞液的滴管吸棄舊液。
4、胰酶消化：加入約1ml(20滴)胰酶到培養(yǎng)瓶里消化。胰酶鋪平培養(yǎng)瓶底為佳。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，但未脫離培養(yǎng)瓶底，立刻用吸細(xì)胞液的滴管吸出胰酶棄去，把細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱讓殘存的胰酶繼續(xù)消化，(在37℃胰酶消化效果最佳)。
5、每1min把培養(yǎng)瓶拿到倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)觀察到細(xì)胞變圓，透亮，細(xì)胞間隙明顯增大時,用吸細(xì)胞液的滴管從試管中吸取事先配好的完全培養(yǎng)基3ml加入到培養(yǎng)瓶中終止消化。
6、用吸細(xì)胞液的滴管輕柔吹打，保證培養(yǎng)瓶底的每個角落都吹打到，斜坡處不能忽略(可以把滴管卡在瓶口處吹打斜坡處。吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害。新學(xué)者可固定每個角落包括斜坡處吹打5次，靠近瓶口端處的角落也要吹到)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸細(xì)胞液的滴管移入試管中，再用滴管吹打混勻細(xì)胞懸液。
7、取一滴細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)(此步驟是為了積累培養(yǎng)細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，觀察多少密度的細(xì)胞具體幾天可以長滿,待有經(jīng)驗(yàn)后此步驟可以省略。如需進(jìn)一步進(jìn)行鋪板則一定要計數(shù)!)
8、傳代：不同細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞數(shù)量、生長快慢、難易等，一般按照1：5比例進(jìn)行傳代。先用滴管吹打混勻3ml(60滴)細(xì)胞懸液，取12滴細(xì)胞懸液到培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足完全培養(yǎng)基(培養(yǎng)基:FBS=9:1)使液體總體積達(dá)到4ml，平放到CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
9、收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面整潔。
注意：
(1)對于難消化的細(xì)胞(如Bxpc-3胰腺癌細(xì)胞)在用胰酶消化前，先用1～2ml(即20～40滴，或1～2滴管)4 ℃PBS沖洗一遍，較易消化的細(xì)胞不需要此步驟。
(2)一定要防止細(xì)胞過消化!因過消化，使細(xì)胞成團(tuán)，不均勻，且對細(xì)胞傷害很大，影響細(xì)胞貼壁和導(dǎo)致生長狀態(tài)差等。
* 過消化特征：
a.在沒有加入完全培養(yǎng)基終止消化前就有成團(tuán)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，胰酶里出現(xiàn)很多懸浮物，為掉下來的細(xì)胞。
b.培養(yǎng)瓶底板上本身為白茫茫(細(xì)胞貼壁生長)，而過消化后細(xì)胞脫壁掉下來，則可見培養(yǎng)瓶底板有一片片空隙。
(3)過消化的處理：不吸出胰酶，立刻加入3ml完全培養(yǎng)基終止消化后一并收集入試管中，經(jīng)過800 rpm 離心3min，棄去上清(失活的胰酶、培養(yǎng)基、FBS)。細(xì)胞沉淀(白色沉淀物)在試管底，用手指輕彈打散細(xì)胞，重新加入適量完全培養(yǎng)基，混勻后放入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
(4)在加入未經(jīng)37℃溫育的胰酶(指僅為室溫)消化細(xì)胞時，即使細(xì)胞已經(jīng)變圓，且透亮，用完全培養(yǎng)基終止消化后仍很難吹打下來。那是因?yàn)橐让傅臏囟炔贿m宜;而應(yīng)該把殘留有胰酶作用的培養(yǎng)瓶放到CO2培養(yǎng)箱中，放置5min,讓胰酶在其最佳溫度(37℃)下消化細(xì)胞。
(5)把試管中細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中時，每次滴管在試管中取液時都要輕柔吹打液體，以防止細(xì)胞成團(tuán)不均，影響在培養(yǎng)瓶中生長。
(6)用力吹打和氣泡產(chǎn)生對細(xì)胞都有傷害，故應(yīng)輕柔吹打并盡量減少氣泡產(chǎn)生。
(7)吹打結(jié)束使細(xì)胞盡量分離成單個細(xì)胞為宜。
(8)完全培養(yǎng)基為含有10%FBS(胎牛血清)的培養(yǎng)液(基)。
(9)小牛血清使用范圍：5～20%，10%最常用。血清可控制細(xì)胞生長速度，若想減慢細(xì)胞生長速度可減少血清濃度，反之亦然。對于剛復(fù)蘇的細(xì)胞需要的營養(yǎng)成分更多些，則血清用20%。
(10)一般25c㎡培養(yǎng)瓶需培養(yǎng)液5ml，通常需90滴培養(yǎng)基+10滴胎牛血清(FBS)，一滴液體體積為50ul,即20滴為1ml。
(11)一般細(xì)胞生長鋪至瓶底約80%，則可傳代或用來做實(shí)驗(yàn)，否則細(xì)胞進(jìn)入生長平臺期進(jìn)而缺少營養(yǎng)而狀態(tài)老化，不易用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
3.6 細(xì)胞鋪板(如12孔板)
1、紫外線照臺30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需物品。
2、在滅菌試管1中配完全培養(yǎng)基3ml(培養(yǎng)基:FBS=54滴：6滴)
3、消化同前，注意防止過消化。吹打混勻計數(shù)，如為：8.0×10 5個/ml
4、稀釋細(xì)胞懸液：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞密度0.8×10 5個/ml較合理，因每孔需加培養(yǎng)液1ml，共需12ml,分2次，每次6ml(因試管體積有限，6ml即120滴)，則配制細(xì)胞懸液： 8.0×10 5個/ml ×x ml = 0.8×10 5個/ml × 6ml，x=0.6ml
即 細(xì)胞原液： 0.6ml×20滴/ml=12滴
完全培養(yǎng)基： 6ml-0.6ml=5.4ml (5.4×20滴=108滴)
97滴培養(yǎng)基+ 11滴FBS
故取12滴細(xì)胞懸液、108滴完全培養(yǎng)液加入試管中。用吸細(xì)胞液的滴管吹打混勻細(xì)胞懸液。
5、在超凈工作臺里打開細(xì)胞板，鋪板，注意無菌操作。每孔1ml(20滴)，分4次滴加，每次5滴，按順序依次滴入。注意：每次從試管中吸細(xì)胞懸液時都應(yīng)吹打以使細(xì)胞均勻!
6、繼續(xù)稀釋細(xì)胞懸液6ml，操作同前。
7、加完之后，小心平穩(wěn)地將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置5min后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否鋪均勻，如不均勻，將影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，則需在細(xì)胞板內(nèi)吹打混勻細(xì)胞：因孔內(nèi)細(xì)胞懸液1ml，采用700ul槍吹打(不能用滴管，會刮花底面)，可以輕輕抵著底面往各個方向吹打。
注意：小心吹打，最好不要起氣泡，否則會導(dǎo)致細(xì)胞不均，且影響觀察。吹打后放倒置顯微鏡下觀察，若不夠均勻，繼續(xù)吹打。將細(xì)胞板拿出操作臺時需蓋板蓋，避免污染。
8、吹打完畢后，小心將細(xì)胞板放CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(注意：拿細(xì)胞板避免晃動，最好直拿直放，不要推動移動，否則細(xì)胞容易成團(tuán)。)
9、清潔操作臺面，用75%酒精噴灑操作臺，擦臺。
注意：(1)若鋪96孔板，則需在96孔板周圍一圈孔中加入PBS，防止干燥。
(2)各種不同規(guī)格板的鋪板細(xì)胞數(shù)量：
3.7 細(xì)胞凍存
1、冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase)且存活率高之狀態(tài)，約為80–90%致密度。
2、依細(xì)胞傳代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞于試管中，取少量細(xì)胞懸浮液，計數(shù)細(xì)胞濃度，一般凍存細(xì)胞濃度約1～5×106 cells/ml，依細(xì)胞種類而異。
3、用試管塞塞住試管，配平，800 rpm 離心3min，去除上清液，加入適量完全培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻。
4、吸取16滴細(xì)胞懸液到凍存管中，再加入2滴FBS，2滴DMSO(二甲基亞砜，為細(xì)胞凍存保護(hù)劑)，使FBS濃度為20%，DMSO濃度為10%。蓋緊凍存管蓋，在壁上標(biāo)記好凍存細(xì)胞名稱、凍存年月日。
5、把凍存管放到-70℃冰箱程序降溫盒中24小時(勿超過1周)，然后轉(zhuǎn)移到-196℃液氮罐中長期保存。
注意：
(1) 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
(2)冷凍保存之細(xì)胞濃度：
?、賜ormal human fibroblast:1～3×106cells/ml
?、趆ybridoma：1～3×106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。
?、踑dherent tumor lines：5～7×106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
?、躱ther suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
(3)冷凍保護(hù)劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
(4)DMSO(二甲基亞砜)在常溫下對細(xì)胞毒性較大，而在4℃時，其毒性大大減弱，且能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)，故凍存細(xì)胞時使用室溫下的DMSO，在凍存的細(xì)胞復(fù)溫后，應(yīng)及時洗滌冷凍保護(hù)劑DMSO(離心后棄去上清)，防止DMSO對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
