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PCR實驗室為什么要三區(qū)隔離？
發(fā)布：admin 發(fā)布時間：2020-06-01 15:26:40 瀏覽：
我們之前碰到過一些客戶，說做PCR實驗總是出現假陽性，明明沒有加模板最后卻擴出了產物。如果這種現象頻頻出現，就要注意一下操作環(huán)境了。如果你去百度上搜索“PCR出現假陽性了怎么辦”，下面給出的建議一定會有防止交叉污染這條建議。有人說模板DNA是大分子，溶于去離子水中，怎么會無緣無故跑出來污染環(huán)境呢?環(huán)揚未來實驗室小編將會一一解釋。
這里涉及一個氣溶膠的概念，氣溶膠是由固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系，能在空氣中滯留至少幾個小時。PCR反應過程中不斷進行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，PCR管中空氣的部分形成了氣溶膠，攜帶了大量DNA擴增產物(注意1ng擴增產物中可作為模板的DNA片段的數量超過1ng起始模板中可擴增DNA片段數量的幾百萬倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個bp，要擴增的單拷貝基因片段是300 bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬分之一)。如果在實驗室打開含PCR擴增產物的管蓋，大量攜帶DNA擴增產物的氣溶膠就會涌出，擴散到空氣中，從而對環(huán)境造成污染。雖然在整個空間環(huán)境中DNA的含量很低，但是由于理論上只要有1個可做為模板的DNA 片段也能PCR擴增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。
所以在專業(yè)的PCR實驗(比如臨床PCR檢驗實驗室)室通常有四區(qū)隔離(或至少是三區(qū)隔離)的要求。
常見的三區(qū)指的是：
1、試劑配制區(qū)：PCR反應體系的配制區(qū)域。
2、標本處理區(qū)：包括擴增模板的制備，也就是我們常常提取DNA的地方;
3、PCR擴增和產物分析區(qū)：進行PCR擴增的區(qū)域，也是擴增產物進行凝膠電泳分析的區(qū)域。
如果將PCR擴增區(qū)域和產物分析區(qū)再次分開，就是四區(qū)隔離了。
四區(qū)隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個PCR區(qū)域之間的流動—最好的方法是干脆每個區(qū)域隔一幢樓，那肯定是最佳的隔離措施了，但操作起來肯定不現實，于是便有了針對不同區(qū)域設置正負壓的方法：
試劑配制區(qū)(Ⅰ區(qū))：最潔凈的區(qū)域，保持微正壓使得外界空氣無法進入隔離污染源。并且陰性模板應該在此區(qū)加入PCR管并蓋蓋，嚴禁在此區(qū)域打開、存放裝有DNA模板的離心管;
DNA模板添加區(qū)(Ⅱ區(qū))：保持微負壓，保證內部空氣不外泄，以免陽性模板的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。
擴增及PCR產物分析區(qū)(Ⅲ區(qū))：保持微負壓，使得內部空氣不外泄，以免擴增產物的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。
操作時遵循Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)單一方向進行，不可逆向進行。
對于科研用途的PCR實驗室，如果無法達到嚴格的三區(qū)隔離的要求，至少也要做到兩區(qū)隔離：即正壓區(qū)和負壓區(qū)。正壓區(qū)實施Ⅰ區(qū)的功能，負壓區(qū)實施Ⅱ區(qū)，Ⅲ區(qū)的功能。
最忌諱也是最可怕的是反過來，在正壓區(qū)實施Ⅲ區(qū)的功能。我們有個用戶的所有實驗室都是正壓—因為進入實驗室的空氣都是經過過濾的。他信心滿滿地認為他們的實驗室超干凈，做PCR絕對沒問題，但他們實驗室出現了最嚴重的PCR產物污染問題—所有的陰性對照都是陽性。所以PCR實驗室的潔凈度是次要的，不同區(qū)域間的空氣是互相之間否有流通才是最關鍵的。
如果有的同學問，我們的實驗室沒有正負壓的區(qū)分，或者是全負壓，全正壓怎么辦呢?那我們的建議是：別怕麻煩，找個遠離Ⅲ區(qū)(通俗地講就是打開PCR擴增產物的蓋子區(qū)域，比如電泳區(qū))的實驗室當做PCR I區(qū)使用，能省掉后續(xù)更多的麻煩。
既然PCR三區(qū)隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請注意以下細節(jié)，思考一下氣溶膠來自哪里：
1. 每個區(qū)域都應配備專用的移液器，不可交叉混用。我們的一位用戶拿電泳室的移液器加模板，陰性對照擴出了很亮的條帶。
2. 每個區(qū)域都應配備專用的移液器吸頭，不可交叉混用。
3. 如果條件允許，在PCRⅢ區(qū)工作結束后再次進入PCR I區(qū)需要更換實驗服、一次性鞋套、帽子、手套。
4. 在PCR I區(qū)、PCRⅡ區(qū)配備帶濾芯吸頭。
很多做PCR的同學會將做PCR的吸頭滅菌、或者是在超凈臺做PCR操作。但在小編看來這完全沒有必要，因為做好PCR最重要的是防止擴增產物的污染，而不是無菌操作!試想一下，高壓滅菌了又如何，DNA并不會因此而降解多少，如果細菌的DNA會參與PCR擴增，那么無論活菌或是細菌尸體都一樣能擴增出DNA 條帶。
